Objective: Low glutamine levels have been shown in tumor environments for several cancer subtypes. Therefore, it has been suggested that cancer cells rewire their metabolism to adopt low nutrient levels for survival and proliferation. Although glutamine is a non-essential amino acid and can be synthesized de novo, many cancer cells including malignant hematopoietic cells have been indicated to be addicted to glutamine. This study aimed to investigate the proliferation of leukemia cell lines in glutamine-deprived conditions.
Materials and methods: Cell proliferation of K562, NB-4, and HL-60 cells was determined by calculating cell numbers in normal vs. low glutamine media. Changes in mRNA expressions were investigated using qRT-PCR. The glutamine synthetase (GS)-encoding GLUL gene was knocked out (KO) in HL-60 cells using the CRISPR/Cas9 method and protein expression was evaluated with immunoblotting.
Results: The proliferation of all cell lines was decreased in glutamine-deprived medium. GS protein expression was increased in glutamine-limited medium although the mRNA level did not change. Increased protein expression was confirmed with inhibition of new protein synthesis by treating cells with cycloheximide. To further investigate the role of GS protein, the GS-encoding GLUL gene was KO in HL-60 cells using the CRISPR/Cas9 method. GS KO cells proliferated less compared to control cells in glutamine-limited medium.
Conclusion: Our results indicate that upregulated GS protein expression is responsible for glutamine addiction of leukemia cell lines. Exploiting the genetic and metabolic mechanisms responsible for GS protein expression could lead to the identification of new anti-cancer drug targets.
Amaç: Farklı kanser alt tiplerinde tümör çevresinde düşük glutamin seviyeleri gösterilmiştir. Bu nedenle, kanser hücrelerinin hayatta kalmak ve çoğalabilmek için düşük besin seviyelerinde metabolizmalarını yeniden yapılandırdığı öne sürülmüştür. Glutamin esansiyel olmayan bir amino asit olmasına ve de novo sentezlenebilmesine rağmen, malign hematopoietik hücreler de dahil olmak üzere birçok kanser hücresinin glutamine bağımlı olduğu belirtilmiştir. Bu çalışmada lösemi hücre hatlarının glutaminden yoksun koşullarda çoğalmasının araştırılması amaçlandı.
Gereç ve yöntemler: K562, NB-4 ve HL-60 hücrelerinin hücre proliferasyonu, normal ve düşük glutamin ortamında hücre sayıları hesaplanarak belirlendi. mRNA ifadelerindeki değişiklikler qRT-PCR kullanılarak araştırıldı. Glutamin sentetaz (GS) kodlayan GLUL geni, CRISPR/Cas9 yöntemi kullanılarak HL-60 hücrelerinde susturuldu ve protein ekspresyonu immünoblotlama ile değerlendirildi.
Bulgular: Tüm hücre hatlarının proliferasyonu, glutaminden yoksun ortamda azaldı. GS protein ekspresyonu, mRNA seviyesi değişmemesine rağmen, glutamin yoksun ortamda artmış olarak belirlendi. Artan protein ekspresyonu, hücrelere sikloheksimid ile muamele edilerek yeni protein sentezinin inhibisyonu immünoblotlama ile tespit edildi. GS proteininin rolünü daha fazla araştırmak için, GS kodlayan GLUL geni, CRISPR/Cas9 yöntemi kullanılarak HL-60 hücrelerde susturuldu. GS susturulmuş hücreler glutamin sınırlı ortamda kontrol hücrelerine kıyasla daha az çoğaldı.
Sonuç: Sonuçlarımız, artmış GS protein ekspresyonunun lösemi hücrelerinde glutamin bağımlılığından sorumlu olduğunu göstermektedir. GS protein ekspresyonunun düzenlenmesinde görev alan genetik ve metabolik mekanizmaların aydınlatılması ile yeni kanser önleyici ilaç hedefleri tanımlanabilir.
Keywords: Crispr/Cas9; Glutamine limitation; Glutamine synthetase; Leukemia.