This report describes a whole-blood flow cytometric method for the determination of intracellular cytokines IFN-gamma and IL-4 in canine T lymphocyte subpopulations. Conjugated anti-cytokine antibodies and commercially available reagents for cell fixation and permeabilization were used. Canine peripheral blood was cultured with a combination of phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) and ionomycin to promote cytokine synthesis in each cell, along with monensin to increase the sensitivity of the method by retaining IFN-gamma and IL-4 within the cell to detectable levels. The optimum concentrations of PMA and ionomycin were determined. Maximum IFN-gamma expression from both CD4+ and CD8+ T lymphocytes was detected after 6 h of incubation of cell culture, while maximum IL-4 production took 6 h from CD4+ cells and 4 h from CD8+ cells. This method is a simple immunologic technique for measuring intracellular cytokines which could be of value in the investigation of canine immunological response mainly in various intracellular and extracellular infections, since IFN-gamma and IL-4 are considered key cytokines activating the cellular and humoral immunity, respectively.
Cet article décrit une méthode de cytométrie en flux utilisant du sang entier pour la détermination des cytokines intracellulaires IFN-γ et IL-4 dans les sous-populations de lymphocytes T canins. Des anticorps conjugués anti-cytokines ainsi que des réactifs commerciaux pour la fixation et la perméabilisation cellulaire ont été utilisés. Du sang périphérique canin a été mis en culture avec une combinaison d’acétate de phorbol-12-myristate-13 (PMA) et de l’ionomycine afin de promouvoir la synthèse de cytokine dans chaque cellule, ainsi qu’avec du monensin afin d’augmenter la sensibilité de la méthode en maintenant l’IFN-γ et l’IL-4 dans les cellules à des seuils détectables. Les concentrations optimales de PMA et d’ionomycine ont été déterminées. L’expression maximale d’IFN-γ par les lymphocytes T CD4+ et CD8+ a été détectée après 6h d’incubation de la culture cellulaire, alors que la production maximale d’IL-4 à pris 6 h pour les cellules CD4+ et 4 h pour les cellules CD8+. Cette méthode est une technique immunologique simple pour mesurer les cytokines intracellulaires qui pourrait s’avérer intéressante dans l’étude de la réponse immunologique canine principalement lors d’infections intra- et extracellulaires variées, compte tenu du fait que IFN-γ et IL-4 sont considérés comme des cytokines importantes activant respectivement, l’immunité cellulaire et l’immunité humorale.
(Traduit par Docteur Serge Messier)