Technologies in the Whole-Genome Age: MALDI-TOF-Based Genotyping

Transfus Med Hemother. 2009;36(4):253-262. doi: 10.1159/000225089. Epub 2009 Jul 10.

Abstract

With the decipherment of the human genome, new questions have moved into the focus of today's research. One key aspect represents the discovery of DNA variations capable to influence gene transcription, RNA splicing, or regulating processes, and their link to pathology. Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) is a powerful tool for the qualitative investigation and relative quantification of variations like single nucleotide polymorphisms, DNA methylation, microsatellite instability, or loss of heterozygosity. After its introduction into proteomics, efforts were made to adopt this technique to DNA analysis. Initially intended for peptide/protein analysis, it held several difficulties for application to nucleic acids. Today, MALDI-TOF-MS has reached worldwide acceptance and application in nucleic acid research, with a wide spectrum of methods being available. One of the most versatile approaches relies on primer extension to genotype single alleles, microsatellite repeat lengths or the methylation status of a given cytosine. Optimized methods comprising intelligent primer design and proper nucleotide selection for primer extension enabled multiplexing of reactions, rendering the analysis more economic due to parallel genotyping of several alleles in a single experiment. Laboratories equipped with MALDI-TOF-MS possess a universal technical platform for the analysis of a large variety of different molecules.

Mit der Entzifferung des humanen Genoms sind neue Fragestellungen in den Mittelpunkt heutiger Forschung getreten. Eine zentrale Rolle spielt die Erforschung von Sequenzvariationen der DNA, die Einfluss auf die Transkriptionsrate, das Spleißen oder die Regulation verschiedener Gene haben und zu pathologischen Veränderungen führen können. Die Matrix-assistierte Laser-De-sorption-und-Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) hat sich als ein geeignetes Werkzeug nicht nur zur qualitativen Untersuchung, sondern auch zur relativen Quantifizierung von Einzelbasenaustauschen, DNA-Methylierung, Mikrosatelliteninstabilitäten oder dem Verlust der Heterozygotie erwiesen. Nach Einführung der ursprünglich für die Untersuchung von Peptiden und Proteinen entwickelten Methode wurde diese Technik für die Nukleinsäureanalyse weiterentwickelt und zur Anwendung gebracht. Nach anfänglichen Schwierigkeiten bei der Anpassung an die Nukleinsäu-reanalytik hat MALDI-TOF-MS mittlerweile eine große Akzeptanz und eine breite Anwendung in der Analyse dieser Molekülklasse erreicht. Die Hauptanwendungsgebiete basieren auf einer Primer-Verlängerungsreaktion die zur Genotypisierung einzelner Allele und zur Bestimmung der Mikrostellitenlänge oder des Cytosin-Methy-lierungsgrads verwendet werden. Derzeit stehen optimierte Methoden mit einem intelligenten Primer-Design und genauer Nukleotidzusammensetzung zur Primer-Verlängerung zur Verfügung, die eine Vervielfältigung der Reaktionen in einem Ansatz ermöglichen und somit durch parallele Genotypisierung mehrerer Allele Kosten einsparen. Insgesamt verfügen Labors mit einer MALDI-TOF-MS-Ausstattung über eine Plattform zur breiten Analyse von Makromolekülen verschiedenster Art.