Background: Bacteriophages encode endolysins to lyse their host cell and allow escape of their progeny. Endolysins are also active against Gram-positive bacteria when applied from the outside and are thus attractive anti-bacterial agents. LysK, an endolysin from staphylococcal phage K, contains an N-terminal cysteine-histidine dependent amido-hydrolase/peptidase domain (CHAP(K)), a central amidase domain and a C-terminal SH3b cell wall-binding domain. CHAP(K) cleaves bacterial peptidoglycan between the tetra-peptide stem and the penta-glycine bridge.
Methods: The CHAP(K) domain of LysK was crystallized and high-resolution diffraction data was collected both from a native protein crystal and a methylmercury chloride derivatized crystal. The anomalous signal contained in the derivative data allowed the location of heavy atom sites and phase determination. The resulting structures were completed, refined and analyzed. The presence of calcium and zinc ions in the structure was confirmed by X-ray fluorescence emission spectroscopy. Zymogram analysis was performed on the enzyme and selected site-directed mutants.
Results: The structure of CHAP(K) revealed a papain-like topology with a hydrophobic cleft, where the catalytic triad is located. Ordered buffer molecules present in this groove may mimic the peptidoglycan substrate. When compared to previously solved CHAP domains, CHAP(K) contains an additional lobe in its N-terminal domain, with a structural calcium ion, coordinated by residues Asp45, Asp47, Tyr49, His51 and Asp56. The presence of a zinc ion in the active site was also apparent, coordinated by the catalytic residue Cys54 and a possible substrate analogue. Site-directed mutagenesis was used to demonstrate that residues involved in calcium binding and of the proposed active site were important for enzyme activity.
Conclusions: The high-resolution structure of the CHAP(K) domain of LysK was determined, suggesting the location of the active site, the substrate-binding groove and revealing the presence of a structurally important calcium ion. A zinc ion was found more loosely bound. Based on the structure, we propose a possible reaction mechanism. Future studies will be aimed at co-crystallizing CHAP(K) with substrate analogues and elucidating its role in the complete LysK protein. This, in turn, may lead to the design of site-directed mutants with altered activity or substrate specificity.
Introducción: Los bacteriófagos codifican endolisinas para lisar sus bacterias hospedadoras y permitir la liberación de su progenie. Las endolisinas también son activas contra bacterias Gram positivas cuando se aplican desde el exterior, y por lo tanto, son consideradas agentes antibacterianos atractivos. LysK, una endolisina del fago K que infecta estafilococos, contiene un dominio N-terminal amidohidrolasa/peptidasa dependiente de cisteína e histidina (CHAPK), un dominio amidasa central y un dominio C-terminal SH3b de unión a la pared bacteriana. CHAPK corta el peptidoglicano bacteriano entre el tetrapéptido y los puentes pentaglicina.
Métodos: El dominio CHAPK de LysK fue cristalizado y se obtuvieron datos de difracción a alta resolución tanto de un cristal de proteína nativo como de un cristal derivado con cloruro de metilmercurio. La señal anómala presente en los datos derivados permitió la localización de la posición de los átomos pesados y la determinación de la fase. Las estructuras resultantes se completaron, refinaron y analizaron. La presencia de iones de calcio y zinc en la estructura fue confirmada por espectroscopía de emisión de fluorescencia de rayos X. Se llevaron a cabo análisis de zimograma sobre la enzima nativa y sobre mutantes puntuales seleccionados.
Resultados: La estructura de CHAPK reveló una topología tipo papaína con un bolsillo hidrofóbico donde se localiza la tríada catalítica. Moléculas de tampón ordenadas presentes en este hueco pueden mimetizar el substrato de peptidoglicano. Cuando se compara con dominios CHAP resueltos previamente, CHAPK contiene un lóbulo adicional en su dominio N-terminal, con un ión de calcio estructural, coordinado por los residuos Asp56, Asp45, Asp47. También se observa la presencia de un ión de zinc en el centro activo, coordinado con el residuo catalítico Cys54 y un posible análogo del substrato. Se usó mutagénesis dirigida para demostrar que los residuos involucrados en la unión a calcio y los presentes en el centro activo propuesto eran importantes para la actividad enzimática.
Conclusiones: Se determinó la estructura del dominio CHAPK de LysK a alta resolución, sugiriendo la localización del centro activo, del bolsillo de unión al sustrato y revelando la presencia de un ión de calcio estructuralmente importante. Se encontró un ión de zinc unido más débilmente. Basándonos en la estructura, proponemos un posible mecanismo de reacción. Futuros estudios tendrán por objeto la cristalización de CHAPK con análogos del sustrato y la elucidación de su papel en la proteína LysK completa. Esto, a su vez, podría conducir al diseño de mutantes puntuales con una actividad o especificidad de sustrato modificada.