Clostridium perfringens (CP) type A and newly created type G strains are the key etiological factors in the induction of necrotic enteritis (NE), an important enteric disease that is responsible for the annual loss of $6 billion in the worldwide poultry industry. Several CP toxin genes were found to be critical in NE pathogenesis in chickens, but limited information is available on the CP lethal toxin tpeL gene. In this study, 19 CP strains isolated from NE-affected chicken farms were characterized microbiologically and molecularly and evaluated for their pathogenicity in commercial broiler chickens. Toxin typing by PCR revealed that all strains tested were positive for the netB toxin gene, but only five strains were positive for the tpeL toxin gene (LLY-TpeL 13, -TpeL 15, -TpeL 17, -TpeL 18, and -TpeL 19, simplified as TpeL 13, TpeL 15, TpeL 17, TpeL 18, and TpeL 19). High levels of TpeL proteins were detected in the concentrated culture supernatant from strains TpeL 13, 15, 17, and 19 by western blotting. Quantitative PCR showed that strains TpeL 13, 15, 17, 18, and 19 harbored a high number of copies of tpeL genes, while TpeL 18 had the highest number of copies of the tpeL gene among all CP strains tested when normalized with copy numbers of 16S rRNA gene as a housekeeping gene marker. The in vivo NE challenge test using multiple oral CP inoculations combined with a high-protein diet showed that TpeL 17 was the most virulent in inducing typical NE lesions, followed by TpeL 19 as the next most virulent, when tested in commercial broiler chickens. Infection with TpeL 17 reduced the growth rate significantly, as shown by reduced relative body weight gain percentage at day 5 postinfection. Availability of the virulent netB+tpeL+ CP strains is essential for the development of a CP-alone NE challenge model that could provide significant tools for understanding CP pathogenesis and for development of alternative to antibiotics.
Caracterización de cepas virulentas de Clostridium perfringens netB+/tpeL+ de granjas de pollos de engorde con enteritis necrótica. Clostridium perfringens (CP) tipo A y los tipos nuevos G son los factores etiológicos clave en la inducción de enteritis necrótica (NE), una enfermedad entérica importante que es responsable de pérdidas anuales de $6 mil millones en la industria avícola mundial. Se ha determinado que varios genes de toxinas de C. perfringens son críticos en la patogénesis de la enteritis necrótica en pollos, pero se dispone de información limitada sobre el gene tpeL de la toxina letal de C. perfringens. En este estudio, se caracterizaron microbiológicamente y molecularmente 19 cepas de C. perfringens aisladas de granjas avícolas afectadas por enteritis necrótica y se evaluaron en su patogenicidad en pollos de engorde comerciales. La tipificación de toxinas por PCR reveló que todas las cepas analizadas fueron positivas para el gene de la toxina netB, pero solo cinco fueron positivas para el gene de la toxina tpeL (LLY-TpeL 13, -TpeL 15, -TpeL 17, -TpeL 18, y -TpeL 19, simplificado como TpeL 13, TpeL 15, TpeL 17, TpeL 18 y TpeL 19). Los altos niveles de proteínas TpeL se detectaron en el sobrenadante del cultivo concentrado de las cepas TpeL 13, 15, 17 y 19 mediante inmunoelectrotransferencia tipo Western. La PCR cuantitativa mostró que las cepas TpeL 13, 15, 17, 18 y 19 albergaban un alto número de copias de los genes tpeL, mientras que TpeL 18 mostró el mayor número de copias del gene tpeL entre todas las cepas de C. perfringens analizadas cuando se normalizó con los números de copias del gene 16S rRNA como un marcador genético constitutivo. La prueba in vivo de desafío de enteritis necrótica utilizando múltiples inoculaciones orales de C. perfringens combinadas con una dieta alta en proteínas mostró que TpeL 17 fue la más virulenta en la inducción de lesiones típicas de enteritis necrótica, seguida de TpeL 19 como la siguiente más virulenta cuando se inoculó en pollos de engorde comerciales. La infección con TpeL 17 redujo significativamente la tasa de crecimiento, como lo demuestra la reducción del porcentaje de aumento de peso corporal relativo en el día cinco posterior a la infección. La disponibilidad de las cepas netB+ tpeL+ de C. perfringens virulentas es esencial para el desarrollo de un modelo de desafío enteritis necrótica únicamente con C. perfringens que podría proporcionar herramientas significativas para comprender la patogénesis de C. perfringens y para el desarrollo de alternativas a los antibióticos.
Keywords: Clostridium perfringens; necrotic enteritis; netB; tpeL; virulence.